CELL｜重组AAV衣壳定向进化技术
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重组腺相关病毒（rAAV）是目前基因治疗领域运用最广泛，安全性最佳的载体修饰目标之一。通过对AAV外壳进行改造，可以极大优化其组织特异性。
尽管如此，采用AAV进行基因治疗依然有数个需要攻克的难题，其中比较标志性的有：
肝聚集造成的肝毒性。
若靶组织较大（如骨骼肌）或转导效率不佳，为达到治疗效果需要超高剂量给药，继而引发免疫系统炎症反应。
高剂量给药为病毒生产线带来巨大挑战。
为解决这些问题，来自美国布罗德研究所的Pardis C. Sabeti团队与哈佛大学的Amy J. Wagers团队合作改进了现存的AAV病毒定向进化方法，并在今年9月于Cell杂志在线发表了题为Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species的研究论文。
本文研究人员开发了一种基于转基因RNA表达来体内筛选AAV衣壳变异的定向进化法DELIVER（Directed evolution of AAV capsids leveraging in vivo expression of transgene RNA），并用此方法构造了一组含有RGD基序的全新AAV衣壳（MyoAAV Family）。
MyoAAV依赖整合素异质二聚体（Integrin Heterodimers），能够在低剂量全身给药后高效地将基因传递至小鼠和猴目标肌肉组织中，并拥有显著降低的肝脏聚集性。
DELIVER：MyoAAVs
01 衣壳库建设
库中的每个AAV衣壳变体都包括一个随机的7聚体肽（7-mer peptide），插入到AAV9衣壳高变区VIII（hypervariable region VIII）的第588位和596位氨基酸之间，以确保可变肽序列暴露在衣壳表面。
每个变体还包含了广谱性或目标哺乳动物特异性启动子，使衣壳变体可以在HEK293细胞中培养，并在实验动物体内表达。
02 第一轮选择
通过病毒库测序研究人员鉴别出超过 5,000,000个不同的衣壳变体，在C57BL/6J小鼠体内采用MHCK7启动子通过第一轮筛选获得了在7种肌肉组织（quadriceps、tibialis anterior、gastrocnemius、triceps、abdominal、diaphragm、and heart）中高度表达的30,000 个变体。
03 第二轮选择
第二轮筛选引入了启动子和同义密码子对照，发现来自CK8或MHCK7文库在肌肉中高度表达的前12种衣壳变体中，7聚体的前三个氨基酸均为RGD基序。
从这12个衣壳变体中研究人员将7聚体为RGDLTTP肽的变体命名为MyoAAV 1A，并采用此变体开展进一步研究。
MyoAAV 1A 转导特性
为C57BL/6J 小鼠注射1E+12 vg（4E+13 vg/kg）AAV9-或MyoAAV 1A-CMV-EGFP。
组织免疫荧光检测显示，与注射AAV9的小鼠相比较，注射了MyoAAV 1A的小鼠肌肉中的荧光强度更高；MyoAAV 1A注射小鼠肌肉纤维中的转基因获得更高表达，同时肝脏转导相对减少。
通过对小鼠骨骼肌中EGFP mRNA的定量分析，发现与注射AAV9的小鼠相比，注射MyoAAV 1A的小鼠肌肉中转基因表达高出10至29倍，心脏组织表达量高出6.3倍，肝脏中低2.8倍。
这些结果指出MyoAAV 1A可以高效地特异性转导小鼠肌肉组织。
MyoAAV 1A 临床治疗前景分析：
杜氏肌营养不良
Duchenne Muscular Dystrophy (DMD)
研究表明通过CRISPR-Cas9介导的方法，从mdx小鼠（DMD小鼠模型）细胞的基因组中切除外显子23同时表达肌养蛋白（dystrophin）可用于治疗肌营养不良。
本文作者向mdx小鼠注射AAV9或MyoAAV 1A（AAV9-Dmd CRISPR或MyoAAV 1A-Dmd CRISPR），以及靶向mdx突变的5’和3’端gRNAs。
通过免疫荧光和蛋白质印迹分析发现，与AAV9-Dmd CRISPR相比，注射了MyoAAV 1A-Dmd CRISPR的mdx小鼠肌肉中肌养蛋白的恢复更加明显。
另外注射MyoAAV 1A-Dmd CRISPR的mdx小鼠的胫骨前肌各项肌肉功能指标均优于注射AAV9-Dmd CRISPR的mdx小鼠。
种种结果证明与AAV9相比，MyoAAV 1A 可以更有效率的将治疗性基因编辑复合物递送至目标肌肉组织。
此外，MyoAAV 1A的治疗潜力也在伴X染色体肌管性肌病（XLMTM）的小鼠模型中得到了进一步的验证。
MyoAAV 1A 定向转导机制
MyoAAV 1A与其他筛选出的高效衣壳变体的7聚体肽中均存在RGD基序，因此研究人员推测RGD结合整合素异二聚体可能在MyoAAV 1A转导路径中起到决定性作用。
作者在HEK293细胞中转染编码8种人GRD结合整联蛋白异二聚体的质粒后，比较HEK293中MyoAAV 1A-CMV-Nluc的转导效率，实验提示过表达ɑ8β1、ɑVβ1、 ɑVβ3、 ɑVβ6或 ɑVβ8可以显著增强MyoAAV 1A-CMV-Nluc的转导效率。
在上述提到的在具有促进MyoAAV 1A转导能力的含有aV的整合素异质二聚体中，aVβ6具有最强的衣壳结合能力。
值得注意的是，aVβ6必须存在于肌肉细胞的表面，MyoAAV 1A才能实现最佳转导。
进一步进化
MyoAAV 1A的优异骨骼肌趋向性展示了DELIVER进化方法的惊人潜力，研究人员采用DELIVER开展了进一步的MyoAAV衣壳指向性进化。
MyoAAV 2A
作者创建了一个新的衣壳变体库，库中所有衣壳的第589、590、591位氨基酸被固定为RGD基序，586-588和592-595位氨基酸则随机插入。
通过这轮筛选试验人员获得了第二代包含RGD基序的衣壳变体，并将其命名为MyoAAV 2A （GPGRGDQTTL）
MyoAAV 2A 与 AAV9 及 MyoAAV 1A 相比，都拥有明显更加优异的转导效率，同时也保证了更低的肝聚集。
结语
该文介绍了AAV衣壳定向进化系统DELIVER，并使用此方法获得了拥有超高骨骼肌转导效率的MyoAAV衣壳变体组。这些载体的治疗功效也在多个遗传性肌肉疾病小鼠模型中得到了验证。
DELIVER作为灵活的AAV衣壳编辑工具，可用于筛选高效转导不同物种体内任何靶组织或靶细胞的AAV衣壳变体，帮助试验人员进行人类疾病基因治疗载体的开发。
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南京贝思奥 (BIONCE) 生物科技有限公司成立于2020年，公司致力于基于重组病毒的基因治疗药物的研发、生产与质量控制，并研制具有自主知识产权的临床基因治疗药物。主要用于治疗眼科疾病、神经系统疾病、恶性肿瘤、罕见病等，打造基因治疗技术研发创新基地。
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