基因治疗小圆桌：生物制品宿主细胞残留DNA检测方法简介
宿主细胞是生物制品的基石，哺乳动物细胞系如今已经成为表达制备生物制品最广泛的宿主，常见的宿主细胞有中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）、非洲绿猴肾细胞（Vero）、人肾上皮细胞（HEK 293）等。
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残留DNA的风险
宿主细胞DNA（Host Cell DNA，HCD）是指可能出现于生物制品中的来自宿主细胞的DNA片段。这些DNA尽管有着相同的基本结构单位，但其片段长度不同，以不同的物理形式存在，进入人体后可造成不同程度的后果。现有研究表明，一个功能基因至少在200bp以上，残留DNA片段越大，风险等级越高。因此，为减少残留DNA风险，FDA建议残留DNA片段不大于200bp。DNA片段大小对应风险等级如下表：
注：风险程度依据风险等级递增
1、致癌性
残留DNA的主要致癌机制是引入显性致癌基因，如MYC、RAS，这些显性致癌基因可直接转化正常细胞，使得部分正常细胞分化为瘤性细胞。宿主细胞残留DNA的插入突变，也是致癌性的潜在因素之一。
2、感染性
细胞DNA中可能存在感染性病毒基因组，而感染性病毒基因组能通过复制和转录扩增从而产生感染性病毒粒子，因此，DNA感染性风险可能比致癌性风险更高。
3、免疫原性
由于微生物来源的基因组DNA富含CpG和非甲基化序列，增加了重组蛋白药物在体内的免疫原性风险。例如CpG-rich sequences from bacteria，可能通过TLR（Toll-like receptors）介导引发免疫反应。
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残留DNA的标准
《中国药典》2020版第三部《人用重组单克隆抗体制品总论》3.2.4工艺相关杂质中提出“采用适宜的方法对供试品宿主蛋白质、宿主细胞和载体DNA、蛋白A及其他工艺相关杂质进行检测”。《人用基因治疗制品总论》3.3.1工艺相关杂质中也将宿主细胞DNA残留作为起始原材料来源的工艺相关杂质，应对其进行鉴定、评估，并进行定性和/或定量分析。
美国FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) 》的行业指南中也建议将非致瘤性连续细胞的残留DNA量限制在10 ng/剂以下，DNA大小限制在约200bp以下。我国2022年发布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》中明确规定，“生产若使用了肿瘤细胞系（如 Hela 细胞）、致瘤细胞系，或携带有致瘤基因、病毒来源序列的细胞（如HEK 293T 细胞），在确保无完整活细胞残留的同时，需对DNA 的残留量和残留片段大小进行控制，合理拟定标准限度。如有可能，建议尽量将残留DNA控制在10 ng/剂以内，DNA残留片段的大小控制在 200bp以下”。
各国监管部门对HCD的残留量有明确的规定。FDA指出生物制品宿主细胞DNA残余限度不得超过100pg/剂量，对于大剂量的单抗药物可放宽至10ng/剂量。《欧洲药典》规定生物制品DNA残留量不得超过10ng/剂量。我国参照WHO、FDA和欧盟的标准，对不同生物制品中残余DNA的含量设置了不同的限制要求。
宿主细胞残留DNA的限定标准
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残留DNA的检测方法
《中国药典》2020版三部通则3407规定，对外源DNA残留量测定推荐了三种方法：DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法。其中定量PCR法也是新版《美国药典》唯一推荐的生物制品中宿主残留DNA的检测标准方法。
1、DNA探针杂交法
供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上 ，在一定条件下可与相匹配的带探针标记的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA。但杂交法检测结果与真实的宿主细胞残留DNA含量有很大差异性，并且该方法不稳定，检测时间相对较长。
2、荧光染色法
应用双链DNA荧光染料与双链DNA特异结合形成复合物，在波长480nm激发下产生超强荧光信号，用酶标仪检测520nm处的荧光信号。荧光强度与DNA浓度成正比。该方法荧光信号易受干扰，特异性较差，因此必须避免环境 DNA 污染，且所有使用的材料和试剂都必须不含DNA。
3、定量PCR法
目前最常规的HCD检测方法，其原理是在PCR反应过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，从而对模板进行定量分析。
根据化学原理可分为两种：TaqMan探针法和SYBR染料法。其中，TaqMan探针法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物；而SYBR染料法是在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。TaqMan探针法由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但SYBR染料法则简便易行。
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小结
定量PCR法因其具有高灵敏度、特异性、准确性和耐用性等特点，现已成为生物制品工艺研究和产品质量控制的首选检测方法。但是定量PCR法易受基质干扰，在检测复杂样品时，其准确性和重复性还有待提高。随着细胞/基因治疗等新型疗法的不断出现，业内对药物质检的准确度和稳定性要求越来越高。例如数字PCR技术的应用因其更高的灵敏度、无需标准曲线且可实现绝对定量，未来极有可能作为新的宿主DNA残留的检测方法。
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