基因治疗小圆桌：生物制品中宿主细胞蛋白残留（HCP）检测方法简介



宿主细胞蛋白（host cell protein，HCP）是一类异质性的蛋白污染，是生物制品中无法避免的一类杂质，即使进行多次复杂的分离纯化，HCP也可能与产品共同纯化，或随产品而分离。残留HCP可能会影响产品的安全性和功效，因此建立合适的残留量检测方法将有助于监测生产工艺，确保生物制品的质量和安全。

残留HCP的标准

美国药典规定单抗制品中残留HCP≤100μg/ml；澳大利亚政府规定生物制品中残留HCP不高于10μg/ml。在中国药典（2020年版）中指出宿主残留蛋白不得超过总蛋白量的0.01%。

残留HCP的风险

免疫原性

HCP是具有多种生理化学和免疫学特性的复杂混合物，可能会触发Toll-Like受体介导的先天免疫反应，或者直接由宿主细胞产生的细胞因子刺激机体，产生组胺，发生炎症反应。因此几乎所有HCP都有作为外来蛋白药物的临床安全风险。

佐剂效应

HCP可以作为佐剂增加机体对治疗蛋白的免疫反应，及产生抗抗体“ADA”，从而直接影响药物在生物分布，药代动力学和生物活性。

产品稳定性

某些具有蛋白水解活性的HCP，如果未充分去除或失活，也会影响药品的稳定性和功效。例如宿主细胞产生的蛋白酶，直接与某些抗体的降解有关。

残留HCP检测方法

用于检测HCP的传统方法包括电泳法、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和高效液相色谱（HPLC）等。中国药典中HCP残留量检测方法是ELISA。

ELISA

夹心酶联免疫吸附测定具有重复性好、效率高、操作简便、应用范围大等优点，灵敏度可达0.5ng/ml，较对流免疫电泳高200倍，目前这种方法是HCP测定的行业金标准。但该法需要抗原拥有2个以上的抗体结合部位，否则某些HCP组分会因无法结合抗体而不能被检测到，而且只能进行半定量，因此该法具有局限性。
通用型 HCP ELISA 试剂盒，即商业化的 HCP 试剂盒，其优点是消除了冗长的测定方法开发时间，但是，商业化的试剂盒没有足够广泛的抗体来覆盖到特定细胞系在特定生产条件下的HCP，从而无法检测到某些与产品共同纯化的低水平HCP。
工艺平台或工艺特定型 HCP ELISA，即根据具体工艺流程/单独为某一种药开发的 ELISA方法和配套的试剂，和商业ELISA试剂盒相比，平台或工艺特定型HCP ELISA中有更多的特异性抗体来和相应的HCP结合。但是，此检测方法费时且成本较高。

HPLC

HPLC的优点在于分离率和分辨率高、检测灵敏度好、操作自动化、样品用量少、定量精确。其缺点在于如果检测样品中杂蛋白浓度过高，其高峰值会在一定程度上掩盖某些小峰值或蛋白存在点，从而导致低浓度分离检测不完全。此外，样品上样量较少，也会使某些较低含量组分不能得到检出。
基于质谱的HCP分析可以作为一种正交方法来帮助识别HCP。这个方法的基本流程是将含有HCP的样品消化成肽段，通过液相色谱-质谱 (LC-MS) 进行分析，并将结果与整个宿主细胞蛋白质组进行比较以识别样品中所含的HCP种类。基于得到的特异的HCP信息，下游可以设计相应的纯化步骤来有效地去除这些HCP。该方法识别未知蛋白质的能力很强，但结果也只是半定量，另外仪器也很昂贵，使得企业生产成本提高。

电泳法

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白相对分子质量，具有简便、快速、重复性好的优点，也是较早用于检测残留蛋白成分的方法。但是此方法检出水平较低，无法精准定量。
蛋白印迹是在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上增加了特异性抗体的配合，具有较好的特异性，但该法操作复杂且更适合定性分析。
双向凝胶电泳是等电聚焦电泳与十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的结合，可以显示出样品的等电点和相对分子质量，分辨率高，但定量很困难。


其他检测方法

新型检测技术,如邻位连接分析法(PLA)、生物传感器技术等也被用于HCPs检测,但这些方法难以推广使用。

小结

随着生物信息学、蛋白质组学和基因组学等领域的飞速发展，人们对于HCP的认识越来越深入，但对HCP检测仍然难度很大。HCP本身种类繁多且蛋白结构复杂，难以精准分析其成分及结构，而且每种蛋白成分的含量不同，免疫原性也存在着较大差别，因此，想要全面分析残留成分，还需要持续的分析过程选择合适的检测方法。


参考文献：

1.范雯婷(综述),朱为(审校).生物制品中的残留宿主细胞蛋白及其检测方法[J].国际生物制品学杂志,2018,41(4):175-178184

2.王志明.基因工程药物中宿主细胞蛋白的检测与控制[J].中国新药杂志,2016,25(22):2550-2557. 

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