基因治疗小圆桌：生物制品中转染试剂残留检测方法简介

转染(transfection)是真核细胞主动或被动导入外源外源核酸（DNA或者RNA）片段而获得新的表型的过程。通过转染能改变细胞内蛋白表达、改变细胞特性，是研究基因或其产物功能和调控机制的一种非常重要的技术手段。目前，将质粒DNA导入动物细胞的方法有很多种，最常用的方法包括脂质体转染、电转法、显微注射法和磷酸钙共沉淀法等。常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染（transient gene expression，TGE），一类是稳定转染（stable gene expression，SGE）。

转染过程中影响转染效率的因素包括：细胞状态、细胞密度、DNA与转染试剂比例、转染前细胞培养时间、转染试剂孵育时间、培养液体积等。

由于尚难以建立稳定的生产细胞株，在病毒载体的大规模生产（腺相关病毒、慢病毒、腺病毒等）中目前仍依赖于瞬时转染的方法。转染试剂是瞬时转染生产病毒载体的主要原材料之一。作为上游病毒生产的重要原物料之一，转染试剂对病毒载体的产能具有重要影响。转染试剂的转染效率、稳定性都直接影响着大规模病毒载体生产的产能与周期。

自1995年Boussif等首次报道了聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）可用于传递基因之后，PEI便作为一种转染材料被广泛应用于基因治疗、疫苗及其他大分子治疗药物的研发及生产中。目前，PEI以其适用性广泛、成本低廉、操作简便、细胞毒性低、可以在多种哺乳动物细胞中达到较高的转染效率，适用于无血清悬浮转染环境，包装容量不受限制等优势，已经成为病毒生产中被广泛实用的转染试剂之一。

PEI的分子式为(CH2CH2NH)n，结构中含有大量的氨基，可分为直链型(linear PEI,LPEI)和分支型(branched PEI,BPEI)两种结构。通常在分子量相近的条件下,BPEI的基因压缩能力强于LPEI,主要是由于在BPEI结构中,每两个碳原子上就含有伯胺、仲胺及叔胺基团,带有很强的正电荷,更容易与基因通过静电作用结合。

研究表明，PEI的分子量与基因转染效率呈正相关性，而与细胞毒性呈负相关性。其中,分子质量为25 kDa的PEI，由于其较高的转染效率被称为基因转染的“金标准”。

当前，尽管在生物制品的生产中PEI残留通常只作为质量研究项目，收集数据，一般不设置标准。但因其强电荷性和不可降解性也导致了很强的细胞毒性且不易在体内生物降解，因此从生产工艺以及产品安全性的角度出发，需要灵敏且成熟的分析方法对其含量情况进行监控。

ELSD-LT III检测原理

不同分子量PEI的色谱图

HPLC-ELSD分析方法可以很好地满足目前对制剂中痕量PEI残留的分析，分离度好，灵敏度高，具有良好的线性关系、精密度和准确度，保留时间和峰面积的RSD分别在0.1%和1.6%范围内。

ELSD 对所有不挥发溶质都有响应，是一种较理想的通用检测器，其灵敏度高，最低可以检测到 10 ng/μL浓度的PEI残留，不受溶剂成分及温度波动的影响，亦可用于梯度洗脱。但是，由于实际样品的基质比较复杂，应该注意基质污染ELSD检测器的情况，保证该方法的重现性。

电雾式检测器（Charged aerosol detector,CAD）是由美国ESA公司于2004年10月研发而成的具有专利技术的一种新型HPLC检测器，现为Thermo公司独家专利产品。CAD较传统紫外检测器和ELSD有着独到的优势。CAD能兼容等度和梯度洗脱，流速范围比较广，可用于高效液相色谱和超高效液相色谱；在灵敏度、响应一致性、动态范围、重现性等方面都优于ELSD。

与ELSD相比，CAD具有更高的检测灵敏度（CAD 检测限可达1ng/μL）、更好的日内和日间重复性和更宽的线性范围。很多ELSD无法检测到的杂质，在CAD上具有较好的响应。

目前，CAD作为药物全面表征和深入研究的重要补充手段，在药物研发的多个方面展示出特殊的价值；同时，《中国药典》（2020版）已将CAD写入0512 高效液相色谱法通则，适用于非挥发和半挥发性化合物的高灵敏度检测和药物全面表征，应用前景广阔。

随着分析技术的不断发展，杂质研究的策略也变得愈发多样化。随着检测器分辨率以及灵敏度的提高，杂质定量实现了由微量到痕量的飞跃。然而，创新药物研发的不断加速以及不断涌现，对快速定性定量分析的要求也给研究人员带来新的挑战。

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