重组AAV上游生产方式盘点

目前最被认可的rAAV生产方式是使用质粒瞬时转染（瞬转）人胚胎HEK293细胞系。

此方法又可以被细分为两质粒系统和三质粒系统，包含一个带有目的基因的质粒和一到两个辅助质粒。此方法中使用的质粒多携带抗生素抗性基因，便于质粒在大肠杆菌中进行生产。

HEK293细胞作为贴壁细胞，生产成本和生长条件要求较高，所以近年来经过改进的HEK293悬浮细胞系渐渐也开始被应用。

HEK293细胞系培养主要采用混合了胎牛血清，左旋谷酰胺及抗生素的DMEM培养液，而悬浮HEK293细胞系更多培养在无血清F19或Expi293培养基中。根据各自的需求，不同的企业也会使用个性化定制的培养基来达到预期效果。

尽管可以通过降低血清使用量来降低影响，但使用此方案生产的病毒中，来自胎牛血清的动物来源杂质还是需要注意，另外细胞裂解工序也可能会产生多种需要处理的杂质。

采用杆状病毒-Sf9昆虫细胞平台生产rAAV作为采用哺乳动物细胞系的替代方案，在2002年由Kotin的团队提出，目前也已经发展得十分成熟，每个细胞中的病毒产量可以做到与哺乳动物细胞生产量持平。

此方法会使用两种重组杆状病毒来感染Sf9细胞，第一个携带目的基因和AAV ITRs，第二个杆状病毒载体（BEV）协助Rep和Cap的合成。

Sf9细胞系来自永生化Spodoptera frugiperda 蛾卵巢细胞，目前是最常见的用于生产rAAV的昆虫细胞系，无血清培养基常用于培养悬浮Sf9细胞系。

由于感染昆虫细胞的病毒一般不会感染哺乳动物细胞，且无血清培养基不包含血清中的动物来源杂质，杆状病毒-Sf9生产体系的安全系数较高。另外杆状病毒可以辅助AAV的复制，所以此方案也不需要腺病毒（Ad）等辅助病毒的参与。

由于杆状病毒的加入，此方案生产的成品中可能会存在的杆状病毒相关杂质还需进一步慎重考量。

尽管此方案远不如上述两种方案普及，但同时感染重组单纯疱疹病毒（rHSV）可以协助大量生产rAAV，且生产出的病毒也拥有很高的效力。

此方案具有代表性的细胞系是仓鼠BHK21细胞系或HEK293细胞系，细胞会同时被两种rHSV感染，分别是rHSV-AAV（包含目的基因和AAV ITRs）和rHSV-Rep-Cap（包含AAV Rep和Cap的开放阅读框）。

感染后2-3天细胞和培养基会通过多重步骤纯化，以去除来自细胞、HSV和未包装病毒的杂质。已有数个临床试验采用了此方案进行病毒制作，证明了产品的人体适用性。

Clark团队创建了HeLa细胞衍生的稳定转染（稳转）生产细胞系（Producer cell），此细胞系经过编辑包含AAV2的Rep-Cap基因、完整的rAAV载体基因组和一个药物选择标记。此细胞系在感染野生型Ad5后就可以激活rAAV病毒生产。目前可适应无动物来源培养体系的悬浮HeLaS3细胞系是此方案的优秀候选人。

多种稳转包装细胞系（Packaging cell）也在被数个团队研究，HeLa和A549细胞是包装细胞常用的细胞系。包装细胞含有Rep和Cap基因，生产rAAV需要先用野生型Ad5感染细胞，之后感染重组Ad-AAV Hybrid或转染携带rAAV基因组的质粒。

采用HEK293细胞制作稳转生产细胞系也被反复尝试，但由于HEK293细胞持续表达Ad E1基因，会激活AAV P5启动子，继而生产和表达的Rep蛋白会使细胞周期停滞甚至导致细胞凋亡，所以使用HEK293需要通过基因编辑严格控制Rep蛋白的表达。