基因治疗小圆桌：复制型AAV(rc AAV)的产生和检测方法简介

点击蓝字 · 关注我们

腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)为复制缺陷型病毒，属细小病毒家族，至今还没有发现与人类的任何疾病相关，其能定点整合到人类基因组19号染色体上。重组腺相关病毒（recombination adeno-associated virus, r AAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其具备宿主范围广、转染效率高、非致病性、免疫原性低、能够长期表达外源基因的优点，因此r AAV被认为是介导基因治疗的理想载体之一。

据报道，复制型腺相关病毒（Replication Competent AAV, rc AAV）的存在可能不会引起r AAV 产品的显著安全性风险，但是会增强或干扰治疗用r AAV 的作用效果或者导致r AAV 载体基因序列的漂移( mobilization) ，影响其基因组稳定性以及体内转导效率等。因此，规模化生产过程中监测和产品放行时检测 rc AAV 病毒十分重要。

在生产r AAV载体的过程中，表达衣壳蛋白的辅助质粒或宿主细胞DNA会被误包装或重组而形成类AAV病毒颗粒。类AAV病毒颗粒又可分为可复制型和复制缺陷型两类。当r AAV载体基因组、Rep/Cap基因以及ITR序列发生非同源重组，这些重组序列被误包后就形成了具有复制能力的AAV，即rc AAV。

曾有报道在17批不同血清型的r AAV产品中，可表达cap基因的rc AAV污染率可达0.4%-1.0%，如采用非优化工艺进行生产污染率则可高达10%。体内应用r AAV载体后可在多种组织内检出污染的杂质DNA序列，部分DNA序列与AAV的反向末端重复(ITR)相连接存在，并在一定条件下可以释出并具有复制活性。近期有研究表明，cap基因在体内的表达会引起严重的免疫反应，而包装有其他DNA杂质的rc AAV则具有致瘤性或引入抗生素抗性的潜在风险。

为减少rc AAV病毒的出现，有研究曾使用不同的启动子启动cap和rep的表达，或对包装系统进行改构。一种改造方法在包装系统中用异源启动子替换AAV p5启动子，并去除119 bp的野生型AAV序列。然而使用该系统大规模制备AAV时，采用敏感的指示细胞扩增法仍可以检测出产生了rc AAV病毒，鉴定结果显示，rc AAV由AAV载体和包装质粒DNA间非同源重组产生。为防止类似情形出现，有人提出AAV rep和cap基因应尽量分离于2个不同质粒的转录单元中，2个基因均采用异源转录调控序列调控，设置相反的转录方向，用于减少rc AAV病毒的产生概率。考虑到AAV载体序列在被野生型AAV感染的宿主细胞中漂移的情况，使用改造后的ITＲ序列也有助于减少r AAV和野生AAV间的重组。综上，临床级别的AAV载体包装系统在设计时应考虑重组产生rc AAV的可能性，并通过改造减少rc AAV的产生概率。

rc AAV转导细胞后表达的衣壳蛋白被认为是引起细胞免疫毒性的原因之一。采用传统工艺生产的r AAV，rc AAV污染率可高达10%，即使采用优化工艺，rc AAV污染率也可达0.4%-1.0%。因此，r AAV中rc AAV污染率的测定非常必要。

基于细胞培养法的检测方法

该方法的原理是通过不断地细胞传代使得rc AAV实现扩增，之后再利用qPCR或Southern-blot的方法对rc AAV进行检测，能保证检测到的rc AAV都具有复制能力，是目前最常用的检测方法。然而，其检测敏感性依赖于rc AAV对靶细胞的感染效率，导致检测灵敏度降低，因此其检测值有可能会低于实际值。此外，该方法和检测平台建立有一定难度，耗时较长且投入成本较高。

qPCR快检法（直接检测法）

对r AAV的原液或终产品进行核酸提取后，直接利用qPCR法对rc AAV进行检测。选择的靶标基因一般为ITR、Rep、Cap等的连接序列，可实现对rc AAV上两种基因的检测，与单独检测一个基因(Rep或Cap)相比准确度更高。该方法对实验室的硬件要求不高，检测方法和平台建立相对容易，具有检测时间短，检测成本相较于细胞培养法低的优势。由于该方法检测片段短，故不能保证检测目标具备rc AAV复制所需的完整序列，导致检出的rc AAV不一定具有复制能力，检测值相较实际值偏高。

安全、稳定、有效是所有药品最基本的三大要求，基因治疗药物更需要把安全性指标放在首位，虽然近年来国际上已有6个AAV相关的基因治疗产品获批上市，但AAV载体在生产研究中出现的细胞免疫毒性，时刻提醒人们必须对其安全性给予高度关注，rc AAV是类AAV病毒颗粒中危害最大的载体相关性杂志，目前尚无下游纯化技术可以去除，必须从上游工艺加以控制，为降低 rc AAV 产生的可能性，应密切关注包装质粒序列间的相似性；建议对 AAV 在受试者体内细胞中的整合能力和潜在的致癌性进行长期研究和监控。

参考文献：

[1] 卢加琪,韦薇.对重组腺相关病毒基因治疗产品包装体系和分子设计的思考[J].中国药学杂志,2020,55(16):1386-1393.

[2]OGDEN P J，KELSIC E D，SINAI S，et al．Comprehensive AAVcapsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design［J］．Science，2019，366(6469):1139-1143．

[3]ALLEN J M，DEBELAK D J，ＲEYNOLDS T C，et al．Identifi-cation and elimination of replication-competent adeno-associatedvirus(AAV)that can arise by nonhomologous recombinationduring AAV vector production［J］．J Virol，1997，71(9):6816-6822．

[4]MUZYCZKA N.Use of Adeno-Associated Virus as a General Trans-duction Vector for Mammalian Cells［M］．1st ed．Berlin:Curr TopMicrobiol Immunol，1992:97-129．

[5]HALBEＲT C L，STANDAEＲT T A，AITKEN M L，et al．Trans-duction by adeno-associated virus vectors in the rabbit airway:ef-ficiency，persistence，and readministration［J］．J Virol，1997，71(8):5932-5941．

南京贝思奥 (BIONCE) 生物科技有限公司成立于2020年，公司致力于基于重组病毒的基因治疗药物的研发、生产与质量控制，并研制具有自主知识产权的临床基因治疗药物。主要用于治疗眼科疾病、神经系统疾病、恶性肿瘤、罕见病等，打造基因治疗技术研发创新基地。